产品简介

Calcein-AM/PI Double Stain Kit 活死细胞双染试剂盒主要通过两种染料 Calcein-AM 和 PI 对细胞进行活死 鉴别。

Calcein-AM 是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490 nm, Em=515 nm）。它 穿透细胞膜进入细胞后能够被细胞内的酯酶剪切形成 Calcein ，从而被滞留在细胞内 ，发出强绿色荧光。

因其在传统的 Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团 ，增加了疏水性 ，它能够更轻 易穿透活细胞膜。与其它同类试剂（如 BCECF-AM 和 CFDA)相比 ，由于 Calcein-AM 细胞毒性极低 ，是最 适合用于活细胞染色的荧光探针 ，且不会抑制任何细胞功能 ，如细胞增殖和淋巴球的趋化性。死细胞缺乏 酯酶活性 ，因此 ，Calcein-AM 常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI）等联合使用 ，同时进行活细胞和死细 胞的荧光双重染色。碘化丙啶（Propidium iodide ，PI）不能穿过活细胞的细胞膜 ，仅能穿过死细胞膜的 无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的 DNA 双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535 nm, Em=617 nm）。Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用 545 nm 激发，仅可 观察到死细胞。

根据我司优化的实验体系 ，单次就 200 µL 细胞悬液进行染色 ，C331308E 和 C331308S 分别可以做 500 次和 1000 次检测。

产品规格

组分信息

储存条件

冰袋运输；其中 A 组分和 B 组分需-20℃避光干燥保存 ，C 组分-20℃保存 ，经常使用可放在 4℃保存。一 年有效。

注意事项

1.     由于 Calcein-AM 对湿度非常敏感，Calcein-AM 溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根

据单次用量 ，分装密封保存。Calcein-AM 工作液必须现配现用。

2.     碘化丙啶（PI）有一定的致癌性 ，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤 ，需要立即用自来水清洗。

3.     为了您的安全和健康 ，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4.     本产品仅用于科研。

使用说明

1.      工作液的配制

1.1   1×Assay Buffer（反应缓冲液） 的配制

从冰箱内取出 10×Assay Buffer ，根据单次用量于无菌条件取出适量 ，用去离子水（dH2O）做 10 倍稀释 以得到 1×Assay Buffer。

1.2   1×染色工作液的配制

1）先将低温保存的 Calcein-AM 溶液  (2 mM)和 PI 溶液（1.5 mM） 回到室温 20-30 min。 注意：第一次使用可对母液进行分装 ，以减少反复冻融次数。

2）取 5 µL Calcein-AM 溶液  (2 mM)和 15 µL PI 溶液（1.5 mM）加入 5 mL 1×Assay Buffer ，充分混匀。 此时得到 Calcein-AM 的工作液浓度为 2  μM ，PI 的工作液浓度为 4.5  μM。由于不同细胞系的最佳染色条  件不同，初次实验建议做梯度实验 ，以确定 Calcein-AM 和 PI 的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的  探针浓度得到最好的荧光结果。加入 500 µL CFDA-SE 溶剂到 1 管 CFDA-SE 荧光探针中进行溶解，充分混  匀即得到 1000×的储存液。

【注意】该储存液最好在 1 个月内使用完毕，最长不超过 2 个月。剩余储存液请务必分装后于≤-20℃避光 干燥保存 ，避免反复冻融 ，-70℃避光保存可适当延长保存周期。

2.     染色步骤

1)     对于贴壁细胞 ，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA 消化细胞 ，之后离心收集细胞（1000 rpm ，3 min）。 对于悬浮细胞 ，直接离心（1000 rpm ，3 min）收集细胞。

      2)     去上清 ，用 1×Assay Buffer 充分清洗细胞 2~3 次 ，以充分去除残留的酯酶活性。

      3)     用 1×Assay Buffer 制备细胞悬液 ，使其密度为 1×105~1×106 细胞/mL。

4)     取 100 µL 染色工作液加入 200 µL 细胞悬液内 ，混匀 ，37℃孵育 15 min。注意：如果需要 ，可延长 孵育时间至 30 min。

5)     荧光显微镜下使用 490±10 nm 激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光） 以及死细胞（红色荧光）。 另外 ，使用 545 nm 的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下进行检测。

【注意】 可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。

a）用 0.1%皂素或者 0.1-0.5%地高辛孵育细胞 10 min ，或者用 70%乙醇孵育细胞 30 min ，制备死细胞。 

b）用 0.1-10 µM 的 PI 溶液进行死细胞染色，以得到仅对细胞核染色而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。 

c）用 0.1-10 µM 的 Calcein-AM 进行死细胞染色 ，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓  度进行活细胞染色 ，去观察是否活细胞能被染色。